Excreción de los metabolitos de la aflatoxina B1

En Leche de Cerdas y sus Implicaciones (Revisión de Literatura).

Revisión bibliográfica Fuentes: (Pierron, 2016 y Ana-Paula 2012).

Introducción

Las Aflatoxinas (AF) son producidas por el hongo Aspergillus flavus y A. parasiticcus y el riesgo que representan los granos y dietas contaminadas por las AF y dependen principalmente de la edad, el estado de salud de los cerdos y el nivel de contaminación, la sinergia entre micotoxinas y el tiempo de consumo del alimento contaminado. Existen al menos 20 tipos diferentes de FA naturales y los más reconocidas son B1, B2, G1 y G2 (Diekman y Green, 1992; Kabak, 2012). La signología clínica no es muy específica. Los cerdos jóvenes son extremadamente sensibles a las AF, pero la susceptibilidad disminuye con la edad. A concentraciones bajas (20 – 200 ppb), se disminuye el consumo de alimento, reduce la tasa de crecimiento y se presentan inmunodepresión celular La Aflatoxina M1 y humoral, haciendo que los cerdos sean más susceptibles a enfermedades bacterianas, virales y parasitarias, con graves consecuencias en los costos de producción, fallas de de antibióticos, antiparasitarios, fallas vacunales y por aumento de días a mercado. Los efectos inmunosupresores de las AF ya han sido demostrados en animales domésticos.

Los efectos que las toxinas ejercen un efecto negativo sobre el complemento, el interferón y las concentraciones de las proteínas séricas; son básicamente resultantes de los daños hepáticos que ocasionan y de la disminución en la producción de proteínas. Además de comprometer la formación del interferón y el complemento, se sabe que las aflatoxinas disminuyen la capacidad fagocítica de los macrófagos y la migración de linfocitos y leucocitos. Las altas concentraciones (1,000 – 5,000 ppb) producen efectos agudos, incluyendo la muerte, pero es poco frecuente que se presente este tipo de intoxicaciones.

La Aflatoxina M1 es un metabolito de las Aflatoxinas que se ha encontrado en la leche de cerdas alimentadas con dietas contaminadas. Las camadas alimentadas con leche contaminada pueden tener un aumento en la mortalidad y un crecimiento más lento. Los cerdos son una de las especies animales más susceptibles a las FA con efectos tóxicos en el intestino y el hígado (Hussein y Brasel, 2001; Weaver et al., 2013a). La toxicidad aguda después del consumo de dosis altas de FA en cerdos se caracteriza por manifestaciones clínicas como el rechazo del alimento y la reducción de la ganancia de peso, así como los hallazgos histológicos asociados con la disfunción hepática (Miller et al., 1981). Sin embargo, los efectos de la exposición crónica de bajo nivel a las FA suelen ser clínicamente «silenciosos» y más difíciles de documentar (Weaver et al., 2013a).

Los resultados de estudios recientes también indican efectos negativos de las FA sobre el recuento de plaquetas, la albúmina sérica y la homeostasis del calcio en cerdos de cría (Sun et al., 2015). En el estudio de Marin et al. (2002) se concluyó que incluso la exposición subclínica a las FA puede dar lugar a pérdidas económicas debido a la disminución del rendimiento y al deterioro de las funciones inmunológicas (inmunosupresión). Las intoxicaciones experimentales (cerdas que recibieron dietas con AFB1 de 800 ppb, o AFG1 de 800 ppb o AFB1 de 400 ppb y AFG1 de 400 ppb) mostraron linfocitos y macrófagos dañados en lechones lactantes, lo que indica una pérdida de competencia inmunológica debido a la exposición de las cerdas a los AF (Silvotti et al., 1997; Kanora y Maes, 2009).

Los animales domésticos mamíferos como los cerdos excretan la FA y sus metabolitos en la leche, orina y heces o los acumulan en varios tejidos. La aflatoxina M1 (M de milk) fue el primer metabolito de aflatoxina B1 (AFB1) identificado. Entre los diferentes metabolitos que surgen de la biotransformación de Aflatoxina B1 (AFB1) y Aflatoxina B2 (AFB2) en mamíferos, AF-8, 9-epóxido aflatoxicol y AFQ1, dos metabolitos hidroxilados de los compuestos parentales se indican como A. La aflatoxina M1 (AFM1) y la Aflatoxina M2 (AFM2) son motivo de gran preocupación. Las AF originales se absorben a través del revestimiento del tracto intestinal y se transportan por el torrente sanguíneo hacia el hígado donde se produce la bioactivación (la formación de un epóxido reactivo en la posición 8, 9 del anillo terminal).

Los animales domésticos mamíferos como los cerdos excretan la FA y sus metabolitos en la leche, orina y heces o los acumulan en varios tejidos. La aflatoxina M1 (M de milk) fue el primer metabolito de aflatoxina B1 (AFB1) identificado. Entre los diferentes metabolitos que surgen de la biotransformación de Aflatoxina B1 (AFB1) y Aflatoxina B2 (AFB2) en mamíferos, AF-8, 9-epóxido aflatoxicol y AFQ1, dos metabolitos hidroxilados de los compuestos parentales se indican como A. La aflatoxina M1 (AFM1) y la Aflatoxina M2 (AFM2) son motivo de gran preocupación. Las AF originales se absorben a través del revestimiento del tracto intestinal y se transportan por el torrente sanguíneo hacia el hígado donde se produce la bioactivación (la formación de un epóxido reactivo en la posición 8, 9 del anillo terminal).

Pueden unirse covalentemente a los ácidos nucleicos, alterar la estructura y función de las proteínas, bloquear la ARN polimerasa y la translocasa ribosomal. El metabolismo hepático de las FA puede resultar en la producción de metabolitos M1 y M2, que pueden incorporarse a la leche y los productos lácteos (Bognanno et al., 2006; Prandini et al., 2008; Chaytor et al., 2011; Bianco et al., 2012).

La cantidad de AFB1 convertida del alimento en AFM1 en la leche está influenciada por varios factores que incluyen la raza, la salud, el tipo de dieta, la producción de leche, la tasa de ingestión y la digestión, etc., (Duarte et al., 2013). Dependiendo del nivel de contaminación del alimento, aproximadamente el 0,3-6,3% de AFB1 ingerido por el ganado se transforma en AFM1 en la leche (Prandini et al., 2008; Kabak, 2012). El AM1 se ha detectado en la leche de vacas, ovejas, cabras, búfalos, camellos y mujeres (Galvano et al., 1996; Duarte et al., 2013; Bilandzic et al., 2014). Todos los mamíferos que ingieren AFB1 durante la lactancia, excretan pequeñas cantidades de AFM1 en su leche. La AFM1 está clasificada como una sustancia de clase 2B, posiblemente carcinógena para humanos, con evidencia acumulada de carcinogenicidad en animales (Smith et al., 1995). Desde 1991, la Comisión de las Comunidades Europeas ha establecido un límite para AFB1 de 5 μg/kg para dietas para ganado lechero y de 20 μg/kg para dietas para cerdos; desde 1998, la misma Comisión fijó un límite de 50 ng/kg para AFM1 en leche. Para los cerdos, Stoloff (1977) informó el índice de conversión de AFB1 de alimento a hígado es de 800 a 1, mientras que otros autores como Lon Whitlow, describe que para ganado lechero la excreción de AFM1 en leche en ganado bovino es de 100:1.

En el 2003 investigadores italianos: T. Bertuzzi, A. Pietri, G. Barbieri y G. Piva, realizaron un estudio para determinar la tasa de excreción de la AFB1 de alimento de cerda a leche a sus metabolitos. Para ello prepararon un alimento para cerdas lactantes que contenía el 5% de una harina de cacahuate naturalmente contaminada con AF. Se utilizaron 4 cerdas adultas multíparas a partir del parto y se alimentaron durante 7 días con 5 kg de alimento contaminado cada una. Se tomaron muestras diarias de calostro y leche (20-50 ml) de cada cerda durante 10 días después del parto y se almacenaron congeladas a -20°C antes del análisis. La extracción y limpieza de AFM1 de la leche se llevó a cabo con columnas de inmuno-afinidad. Los análisis se realizaron por HPLC con un sistema de detección por fluorescencia.

Se consideraron las cantidades totales de AF individual ingeridas y excretadas en la leche durante todo el período experimental; las tasas de transferencia se calcularon a partir de la ingesta de AFB1 para AFB1 y AFM1; de la ingesta de AFB2 para AFM2. Los límites de detección en alimento y leche fueron respectivamente 50 y 0.1 ng/kg para AFB1; en leche, el límite fue de 0,3 ng/kg para AFM1 y AFM2. La alimentación contenía un nivel medio(no.=4)de6.4±0.5y0.67± 0.05 μg/kg de AFB1 y AFB2, respectivamente. Los niveles de FA en la leche se reportan como media diaria ± desviación estándar de las 4 cerdas. Las muestras de leche mostraron concentraciones muy bajas de AFM1 y AFM2 (valor máximo: 3.9 y 4.6 ng/l, respectivamente), pero también una presencia relativamente constante de AFB1 (valor máximo: 7.7 ng/l), mayor que AFM1. La excreción de AFB1 en la leche de las cerdas podría deberse a un mayor contenido de grasa de la leche (7-8%) en comparación con la leche de vaca, ya que AFB1 es menos polar que la AFM1. El patrón de excreción parece ser diferente entre las toxinas: AFB1 alcanza su valor máximo rápidamente (2 días) y luego disminuye; es lo contrario para AFM1 y AFM2 que aumentan más lentamente, como si el mecanismo de desintoxicación necesitara algunos días para estar completamente activo. Sorprendentemente, todos los niveles de FA parecen disminuir antes de la retirada del alimento contaminado (día 7), pero el AFM1 muestra un pico el día siguiente. Cabe destacar que AFB1 y AFM1 muestran un porcentaje de excreción muy cercano, mientras que la excreción de AFM2 es claramente mayor.

La conclusión de este estudio fue que la excreción de AFB1 como AFM1 en la leche es mucho menor en las cerdas en comparación con las vacas (1-3%). La Comisión de las Comunidades Europeas ha fijado un nivel máximo para AFB1 de 20 μg/kg para piensos completos para cerdos. La presente investigación muestra que si se respeta este límite, la cantidad de aflatoxinas excretadas en la leche de la cerda es muy baja; por lo tanto, el efecto sobre los lechones debe ser despreciable. Sin embargo en un estudio bajo condiciones de contaminación de campo en el 2017 investigadores Serbios realizaron un estudio para determinar los Niveles de aflatoxina M1 en leche de cerda, cuyo objetivo fue investigar los niveles de AFM1 en la leche de las cerdas procedentes de animales criados en la provincia Serbia de Vojvodina y alimentados con el maíz contaminado con AF naturalmente y cosechado a finales de agosto de 2012 y suministrado como alimento en once granjas de cerdos.

Se examinaron un total de 110 muestras de leche de cerdas derivadas de 11 granjas durante la primavera y el verano de 2013. Todas las muestras fueron recolectadas de cerdas durante el tercer al quinto día del período de lactancia. Los criterios de selección de las fincas incluyeron la presencia de maíz contaminado con FA (cultivos 2012 de regiones específicas) en las dietas de las cerdas y la aparición de problemas específicos de salud en los lechones, es decir, reducción de las tasas de crecimiento, diarrea persistente y ausencia o respuesta débil a la terapia antimicrobiana aplicada (Prodanov- Radulovic et al., 2013; Prodanov-Radulovic et al., 2015b). Todas las fincas probadas implementaron programas de vacunación regulares contra los principales patógenos virales y bacterianos en sierras durante la gestación.

Las muestras se recolectaron ordeñando cada cerda por separado, durante el tiempo de lactancia, para recibir 15-20 ml de leche que se mantuvo a -20°C a partir de entonces. En casos particulares, la estimulación artificial por administración intramuscular de oxitocina se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Antes del análisis, las muestras de leche se centrifugaron durante 10 min a 3500 g a 10°C. La capa superior de crema se eliminó por aspiración a través de una pipeta Pasteur. La leche desnatada se usó directamente en la prueba (100 μl por pozo).

Análisis de la muestra. La presencia de AFM1 en la leche de las cerdas se analizó mediante el método de ELISA, utilizando el kit de prueba Ridascreen® Aflatoxin M1 (Art. No. R1121) (R-Biopharm, Alemania. Según la descripción del fabricante, el límite de detección (DL) para la determinación de AFM1 fue de 5 ng/L (ppt). El límite de detección de laboratorio (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ) se determinaron mediante 6 mediciones repetidas de muestra ciega. El LOD se calculó como una suma del valor medio para la muestra ciega y tres desviaciones estándar, y LOQ como la suma del valor medio y la desviación estándar de 10 veces. De esta manera, los valores obtenidos para LOD y LOQ fueron 2.6 ng/L y 5.2 ng/L, respectivamente. El rango de determinación especificado en las instrucciones del fabricante fue de 5-80 ng/L. En el caso de concentraciones más altas de AFM1 que estaban fuera del rango de determinación, la muestra se diluyó adicionalmente dos y tres veces con el tampón de dilución de la muestra incluido en el kit, de modo que los niveles de determinación variaron de 10 a 160 ng/L y 15 -240 ng/L, respectivamente.

La calidad analítica del método ELISA se aseguró mediante la participación en el esquema de pruebas de eficiencia (muestra de leche en polvo FAPAS 04224). La recuperación del método fue del 105% para AFM1. El software especial Rida® Soft Soft (Art. No. Z9999, R-Biopharm, Alemania) se utilizó para la evaluación de inmunoensayos enzimáticos. Los valores se compararon con los derivados de la ecuación de Horwitz (39% y 58%). La precisión obtenida y las recuperaciones cumplen con los requisitos de la Comisión Europea relacionados con el desarrollo de métodos analíticos (CE, 2006).

Análisis estadísticos. Los datos se analizaron utilizando el paquete de estadísticas básicas (Statistics10, Copyright de StatSoft GmbH, Hamburgo). Los resultados se presentaron como las concentraciones mínimas y máximas de AFM1, el valor medio, la varianza, el coeficiente de variación, la media ± desviación estándar (SD), el rango, el modo y la frecuencia del modo y el valor p. El nivel de significación se estableció en 0.05.

Los resultados del estudio establecieron la aparición de AFM1 en muestras de leche de todas las fincas evaluada. En el 97% de todas las muestras analizadas, los niveles de AFM1 estaban por encima del LOD. Se observaron niveles no detectables de AFM1 en solo 3 muestras. Los niveles de AFM1 en muestras positivas oscilaron entre 5 y 165.4 ng/L. Más de la mitad de las fincas probadas (54.5%) revelaron valores medios de AFM1 por encima de 60 ng/L. Al menos una muestra de leche de cada una de cinco granjas tenía niveles de AFM1 por encima de 120 ng/L.

La aparición de AFM1 en leche de diferentes especies animales se ha informado en muchos países (OMS, 2010). Sin embargo, los datos bibliográficos sobre las concentraciones de AFM1 en la leche de las cerdas son escasos, especialmente en comparación con la leche de vaca (Silvotti y otros, 1997; Bertuzzi y otros, 2003; Weaver 2013b). En el presente estudio, se detectó AFM1 en muestras de leche de cerdas en todas las granjas porcinas incluidas en el estudio.

Se sabe que las condiciones climáticas, es decir, la alta temperatura y la humedad en las regiones tropicales y subtropicales favorecen el crecimiento de hongos aspergilos toxigénicos (Kabak, 2012). Además, largos períodos de altas temperaturas y la sequía prolongada en verano en otras regiones también pueden promover el desarrollo de micotoxinas particulares (Bilandzic et al., 2014; Manouras y Malissiova, 2015).

En la región norte de Serbia, el año de producción de cultivos 2011/12 extremada- mente cálido y seco también se caracterizó por los altos niveles de Aflatoxina en el maíz y la consiguiente detección de niveles altos de AFM1 en la leche de vaca (Kos et al., 2013; Kos et al., 2014; Jaksic et al., 2015). Todo el maíz utilizado como alimento para todas las fincas probadas se originó en el distrito de Juznobacki y Sremski. Aunque no está en el alcance directo de este estudio, 7 muestras de maíz de 6 fincas fueron investigadas por otro grupo de investigación que reportó una contaminación con FA superior a 65 μg/kg, mientras que en otras 2 los niveles de contaminación fueron: 4.3 μg/kg; 8.4 μg/kg; 11.8 μg/kg; 12.4 μg/kg, respectiva- mente (Jaksic et al., 2015). Nuestros resultados muestran que el consumo de dichos alimentos contaminados con AF durante el período de estudio dio como resultado la detección del metabolito M1 en la leche de cerdas en todas las granjas de cerdos examinadas.

La leche de cerda no se usa para consumo humano, por lo tanto, no existen niveles regulatorios para AFM1. Sin embargo, de acuerdo con los resultados, la determinación de un nivel de umbral de AFM1 en la leche de cerda como una guía rápida para la detección de aflatoxicosis crónica en cerdas debe investigarse y sugerirse con más detalle. Según Dowling y Brown (2012), cualquier nivel de AFM1 representa el riesgo para los recién nacidos, ya que la leche es su principal alimento a esta edad. Los niveles de AFM1 en la leche alcanzan su concentración más alta 3 días después del consumo de alimento contaminado, mientras que el AFM1 es indetectable 4-5 días después de la extracción de alimento contaminado con AFB1 (Galvano et al., 1996).

Se considera que la tasa de absorción de AFB1 y la excreción de AFM1 en la leche varía de un día a otro y de un ordeño al siguiente (Duarte et al., 2013; Kos et al., 2014). La alimentación contaminada con FA puede causar una disminución relacionada con la dosis en la ingesta de alimento y reducir el aumento de peso, daño hepático, alteraciones de la respuesta inmunológica (inmunosupresión) y, finalmente, pérdidas económicas significativas en la producción porcina (Bryden, 2012; Marin et al., 2002; Weaver et al., 2013a). Sin embargo, bajo condiciones de campo, las micotoxinas generalmente ocurren en concentraciones que conducen a un rendimiento reducido del animal y una inmunosupresión variable sin causar ningún síntoma clínico obvio (Kabak, 2012; Prodanov-Radulovic et al., 2014).

Es especialmente importante señalar que el deterioro de las funciones inmunitarias podría culminar en una disminución de la resistencia del huésped a las infecciones y posiblemente comprometer la inmunidad inducida por la vacuna incluso en animales adecuadamente vacunados (Marin et al., 2002). Los resultados de este estudio son indicativos de la utilidad de la detección de AFM1 en la leche de siembra como una herramienta fácil para la detección de la contaminación por aflatoxina en las cerdas y, en consecuencia, de la interpretación de un posible deterioro del crecimiento de los lechones. Dicha herramienta sería aún más útil si se implementa como una prueba rápida fácil de usar en la granja para la leche de siembra, con el fin de mejorar aún más el diagnóstico clínico preciso y reducir el uso de antibióticos en cerdos.

Además, de acuerdo con la regulación de alimentación serbia, el nivel máximo permitido de AF totales en el maíz fue de 50 mg/kg, mientras que en la alimentación de cerdos fue de 20 mg/kg (Reglamento de Serbia, 2010). Las investigaciones en profundidad, tanto actuales como futuras, sobre la contaminación por FA de la alimentación porcina y la leche de cerdas en Serbia pueden contribuir a la armonización total de la regulación específica de Serbia con el Reglamento relativo de la UE (Comisión Europea, 2002).

El 97% de las muestras de leche analizadas fueron positivas para la presencia de AFM1 por encima del nivel de detección. Los niveles detectados de AFM1 en muestras de leche de cerda examinadas indican claramente el consumo de alimentos contamina- dos en todas las granjas de cerdos durante el período de estudio. Se necesitan pasos adicionales para evitar el uso de tal maíz contaminado como alimento para cerdos. Se debe tener en cuenta la posibilidad de que AFM1 se contamine la leche de las cerdas al interpretar los casos de retraso del crecimiento en lechones.

Es muy importante considerar, que si bien los niveles de Aflatoxinas que en México frecuentemente contaminan las raciones para cerdas (5-50 ppb), difícilmente ocasionan un daño significativo a los adultos. Sin embargo, sí existe la posibilidad de daño a los lechones que consuman la leche proveniente de las cerdas que consuman alimentos contamina- dos con los promedios altos de aflatoxinas (>30 ppb), por la exposición a su metabolito AFM1 y más si fuera durante todo el periodo prolongado. De ahí la importancia de utilizar los métodos preventivos de analizar la materia prima y el alimento y rechazar o diluir los lotes muy contaminados y la inclusión de un adsorbente con alta eficiencia para capturar dicha micotoxina.

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